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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷碱化呈现组学、LC-MS/MS磷碱化位点定量分析技术服务。
因为题头：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
汉语题头：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
买家组织：山东大学
科研涂料：拟南芥侧根
拜谱带来了技木：磷过酸装饰组学、LC-MS/MS磷过酸位点分折
研究方案策略：
PART 01 研究方案成果
01、发展素驱动VIK的磷硝化作用举例说明转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷碱化血清质多组分析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 生张素推动VIK的磷硝化作用及转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷硝化作用科学试验。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过发酵粉双混种杂交定性分析（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶互替显像实验设计（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且身体磷碱化实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。公交实时化学发光法PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素表现正面调节管控 LR 发育期
用进行分析两根VIK T-DNA放进去变化体（vik-2和vik-3），显示与也是型不同于，变化体的LR比热容、LR原基（LRP）和已健康成长的LR偏态缩短，特别的是vik-2（图2）。恰恰相反，过表示VIK的转人类染色体根系展现出LR比热容提升。显然，在vik-2变化体情况下表示VIK的转人类染色体根系恢愎了LR健康成长缺欠。产生阴茎发育期素治理 研究表达，vik-2变化体对产生阴茎发育期素诱惑的LR健康成长发生反应减退，表达VIK在产生阴茎发育期素管控LR健康成长中更好地发挥的关键的功效。 
图2 VIK介导的植物的生长素网络信号环路正向着调整LR的阴茎发育
03、VIK 与ERF13 通过数学人机交互
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双团伙荧光同质 （BiFC）和天然免疫共沉淀物检测（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13双方目的
04、VIK以正反两面馈的措施自我调节ERF13磷过酸
通过磷过酸蛋清组学探讨，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点变异看到显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以正反两面馈途径磷碱化ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷过酸可以淡化ERF13光降解
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过胃中检测和胃中检测，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸虚拟仿真和磷酸灭活转变体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚血细胞手机定位介绍表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷碱化促使了ERF13可降解
06、VIK 介导的 ERF13 磷硝化作用设定 LR 的突然出现
研发进步骤论述了VIK监测的ERF13吸附在侧根（LR）发肓中的的功效。实现比多种转染色体苔藓绿植系的LR表型，会发现了过体现方式ERF13治理和改善了LR的发生，在vik突变性体中类似他们治理和改善的功效资料，而在过体现方式YFP-VIK的底色下类似他们治理和改善的功效减少（图6）。还有，比ERF13的多种磷硝化作用模以训练和磷酸解离突变体的过体现方式苔藓绿植系，会发现了ERF132A-Myc（磷酸解离）的苔藓绿植系LR发生越来越少，而ERF132D-Myc（磷硝化作用模以训练）的苔藓绿植系LR发生略多。他们成果说明，VIK介导的ERF13磷硝化作用和吸附提高了LR的发生。 
图6 VIK介导的ERF13磷碱化催进LR的出显
07、VIK在侧根健康发育中磷酸性反应并保持稳定LBD18淀粉酶
顺利通过解析三个VIK T-DNA加上转变体（vik-2和vik-3），发展与原生态型不同之处，转变体的侧根（LR）溶解度计算、LR原基（LRP）和已成长大的LR同质性下降，特别是在是vik-2（图7）。相反的，过表述VIK的转DNA水稻组植物表演出LR溶解度计算增多。另外，在vik-2转变体底色下表述VIK的转DNA水稻组植物找回了LR成长大偏差。种植素处置调查阐明，vik-2转变体对种植素引发的LR成长大不起功能减小，阐明VIK在种植素调节管控LR成长大中发挥功能的关键功能。 
图7 VIK 在LR养成的过程 中会磷碱化和可靠LBD18核蛋白
PART 02 论文工作小结
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷酸性反应淀粉酶质组学分折筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的出现素的信号调侧根建成
PART 03 拜谱个人总结
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的蛋清质含量质组学、遮盖蛋清质含量质组学、分解代谢组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—二次搬运费长度DIA·磷硝化作用体现组，采用创新生物富集方法+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现动草本植物样板10w+、草本植物样板5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
参看文章：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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